填充色谱柱是色谱分析的核心部件，其性能直接影响分离效果与检测精度。科学规范的使用流程可显著提升柱效、延长使用寿命，以下从装填前准备、上样操作、运行管理及维护保养四方面详解关键要点。
一、装填前预处理
色谱柱筛选与清洗
根据目标物极性选择适配的填料(如非极性C18、极性硅胶)，新旧色谱柱需经甲醇/乙腈超声清洗30分钟，去除保存剂残留。
空柱管先用稀盐酸浸泡2小时，纯水冲洗至中性，再用甲醇润洗，确保内壁无疏水性杂质干扰。
匀浆制备与装填
采用沉降法装填时，将填料制成均匀悬浮液(固含量约5%)，借助真空泵抽吸使填料紧密堆积；干法装填需分层敲击柱体，消除空隙。
柱床两端加装筛板(孔径<填料粒径1/3)，防止填料泄漏，顶部压入玻璃棉固定。
二、上样与运行控制
平衡与活化
新柱使用时，以初始流动相低流速(0.5mL/min)冲洗2小时，排出气泡；反相柱需逐步增加有机相比例至工作条件，避免固定相塌陷。
进样前用空白流动相基线校准，待紫外检测器信号稳定后开始实验。
参数优化原则
流速控制：保持最佳线速度(HPLC一般为1~2mm/s)，过高加剧涡流扩散，过低导致传质阻力增大。
pH范围限制：硅胶基质避免pH>8，聚合物填料耐受范围更广，但特殊pH加速封尾键断裂。
温度管理：升高柱温可改善峰形，但超过60℃易造成键合相流失，需配合温控模块精确控温。
三、日常维护与再生
污染应对策略
脂溶性污染物用梯度淋洗(如甲醇→二氯甲烷→甲醇)；离子型残留采用盐溶液冲洗(0.1M NaCl)。
严重堵塞时拆下柱头，剔除上层变质填料，补充新鲜填料后重新压实。
长期保存规范
短期闲置(<1周)：封存于含流动相的密闭容器，每周通电冲洗30分钟；
长期存放(>1月)：置换为乙腈/异丙醇混合液(1:1)，两端密封后直立放置于阴凉处。
四、关键注意事项
禁止骤变条件：切换流动相时需阶梯式过渡，防止溶剂粘度突变引发柱压剧烈波动；停机前用惰性溶剂(如乙腈)置换缓冲盐溶液。
样品前处理：复杂生物样品需经SPE小柱净化，避免蛋白质沉淀堵塞柱床；进样体积≤柱容量的1%，超载导致拖尾严重。
异常现象诊断：柱压持续升高表明颗粒物堆积，基线漂移提示两相失衡，鬼峰出现多为系统污染所致。
通过精细化操作与定期维护，填充色谱柱的理论塔板数可维持在初始值的90%以上，单次分析时间偏差<2%。实际应用中需结合具体填料特性建立标准化流程，并记录柱效衰减曲线以便及时更换。
